आवश्यक अभिकर्मक
| 1 | अमोनियम बाइकार्बोनेट (Sigma A6141) | कार्यशील सांद्रता 50 mM |
| 2 | डाइथियोथ्रेइटोल (Sigma D5545) | कार्यशील सांद्रता 100 mM |
| 3 | आयोडोएसिटामाइड (सिग्मा I1149) | कार्यशील सांद्रता 200 mM |
| 4 | MS ग्रेड ट्रिप्सिन (सिग्मा T6567) | कार्यशील सांद्रता 13 ng /μl |
| 5 | फॉर्मिक एसिड (मर्क 5.33002.0050) | |
| 6 | एसिटोनाइट्राइल (मर्क 1.00029.2500) |
अभिकर्मक सेटअप (उपयोग से पहले ताजा तैयार करें)
| 1 | डिस्टेनिंग समाधान: 100 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट/ एसीटोनिट्राइल (1:1, v/v) |
| 2 | मिलीक्यू पानी में फॉर्मिक एसिड 5% (v/v). |
| 3 | निष्कर्षण बफर: 5% फॉर्मिक एसिड/एसिटोनिट्राइल (1:2, v/v) |
| 4 | ट्रिप्सिन बफर: 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट में 13 ng/μl ट्रिप्सिन। |
PROCEDURE
कांच की स्लाइड, स्केलपेल को मेथनॉल से पोंछें। कांच की स्लाइड पर स्केलपेल की सहायता से एक्रिलामाइड जेल से प्रोटीन बैंड को निकालें, बिना दाग वाले जेल क्षेत्र से बचें।
काटे गए बैंड को 1 x 1 मिमी आकार के छोटे क्यूब्स में काटें और टुकड़ों को विधिवत लेबल किए गए 1.5 मिली सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें।
1500rpm पर भंवर बनाकर 1 घंटे के लिए मिलिक्यू पानी से जेल बैंड को धोएँ
पानी को त्याग दें और 1 मिली ताजे मिलिक्यू पानी से 1 घंटे के लिए धोने के चरण को दोहराएँ।
3000 rpm पर 20 सेकंड के लिए जेल क्यूब्स को घुमाएँ और पानी को पूरी तरह से हटा दें।
300 μl डिस्टेनिंग घोल डालें और 30 मिनट के लिए 1500 rpm पर भंवर करें, यह दाग की तीव्रता पर निर्भर करता है।
500 μl 100% एसीटोनिट्राइल डालें और कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट या जेल के टुकड़े सफेद होने तक भंवर के साथ इनक्यूबेट करें और सिकुड़ें।
एसिटोनाइट्राइल को पूरी तरह से हटा दें और विलायक को पूरी तरह से वाष्पित करने के लिए शीशियों को 20 मिनट तक खुला रखें।
30-50 μl 13 ng/μl ट्रिप्सिन बफर को इस तरह से डालें कि यह सूखे जेल के टुकड़ों को ढक ले और जेल को संतृप्त करने के लिए इसे बर्फ की बाल्टी या फ्रिज में छोड़ दें।
30 मिनट के बाद, ट्रिप्सिन बफर के स्तर की जाँच करें और यदि आवश्यक हो, तो पाचन चरण के दौरान जेल के टुकड़ों को ट्रिप्सिन बफर से पूरी तरह से ढकने के लिए अधिक ट्रिप्सिन बफर डालें।
जेल के टुकड़ों को ट्रिप्सिन बफर से संतृप्त करने के लिए उन्हें 90 मिनट के लिए और छोड़ दें। शीशियों में ट्रिप्सिन बफर के स्तर की फिर से जाँच करें ताकि पता चल सके कि जैल डूबे हुए हैं या नहीं। यदि आवश्यक हो, तो 10-20μl अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर डालें ताकि एंजाइमी क्लीवेज के दौरान जेल के टुकड़े गीले रहें।
शीशियों को 37°C पर 300 rpm पर रात भर कोमल भंवर के साथ इनक्यूबेट करें।
नमूना शीशियों से ट्रिप्सिन बफर को निकालें और संबंधित ताजा लेबल वाले 0.6 ml माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें।
निष्कर्षण बफर (शुरू में इस्तेमाल किए गए ट्रिप्सिन बफर की मात्रा का दोगुना, आमतौर पर 100μl) को जेल के टुकड़ों वाले नमूना ट्यूब में डालें और 20 मिनट तक जोर से भंवर करें।
निष्कर्षण बफर को एस्पिरेट करें और इसे 0.6 ml माइक्रोसेंट्रीफ्यूज के साथ मिलाएं। ट्यूब।
स्पीड वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके पूरे नमूनों को सुखाएँ और उपयोग होने तक -20 पर स्टोर करें।
अंत में LC/MS विश्लेषण से पहले 3% एसिटोनाइट्राइल के 30 μl में नमूनों को फिर से संगठित करें।
