इन-सॉल्यूशन सैंपल तैयारी

नमूना निष्कर्षण और तैयारी की गुणवत्ता MS परिणामों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करती है। इन-सॉल्यूशन नमूनों के लिए, निम्नलिखित दिशा-निर्देशों का सख्ती से पालन करें:

• किसी भी फ्लास्क, ट्यूब या ग्लास प्लेट (नमूना तैयार करने के लिए) को साबुन (या किसी भी पॉलिमरिक डिटर्जेंट) से न धोएँ। हमेशा, अपने कांच के बर्तनों को गर्म पानी से धोएँ और फिर 70% इथेनॉल या मेथनॉल जैसे कार्बनिक विलायक से धोएँ।

• MS विश्लेषण के लिए सभी बफ़र्स को नए सिरे से तैयार करें।

• महत्वपूर्ण: : मास स्पेक्ट्रोमेट्री विभिन्न संदूषकों, जैसे PEG (पॉलीइथाइलीन ग्लाइकॉल), केराटिन और विभिन्न लवणों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है। इसलिए, पाउडर मुक्त नाइट्राइल दस्ताने का उपयोग करने और धूल-मुक्त वातावरण में काम करने की सलाह दी जाती है।

• महत्वपूर्ण: पसंदीदा MS संगत प्रोटीन निष्कर्षण बफर, इष्टतम ट्रिप्सिन गतिविधि के लिए आदर्श, 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर है। यदि आपने सेल छर्रों (या ऊतकों) को धोने या फिर से निलंबित करने के लिए किसी अन्य बफर का उपयोग किया था, तो डिसल्टिंग (या डायलिसिस) और बफर एक्सचेंज (50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट का उपयोग करके) किया जाना चाहिए। इसे उपयुक्त आणविक भार-कट-ऑफ (MWCO) झिल्ली वाले केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है जैसे कि एमिकॉन अल्ट्रा 0.5 एमएल केन्द्रापसारक फिल्टर जिसमें 3 kDa MWCO (P/N: UFC500324, मर्क मिलिपोर) हो। कृपया प्रोटीन का नमूना 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर में दें।

• महत्वपूर्ण: आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले डिटर्जेंट MS के साथ संगत नहीं हैं। इनमें एनपी-40, ट्राइटन, चैप्स, एसडीएस (सोडियम डोडेसिल सल्फेट) और एलडीएस (लिथियम डोडेसिल सल्फेट), ऑक्टाइल ग्लूकोसाइड और ऑक्टाइल थियोग्लूकोसाइड, सोडियम डीऑक्सीकोलेट, लॉरिल माल्टोसाइड, ब्रिज-35 आदि शामिल हैं। अगर आपको सेल लिसिस के लिए डिटर्जेंट का इस्तेमाल करना है, तो केवल एमएस-संगत डिटर्जेंट का इस्तेमाल करें। कुछ एमएस-संगत डिटर्जेंट नीचे सूचीबद्ध हैं।

  • वाटर्स से रैपिगेस्ट एस.एफ.
    https://www.waters.com/nextgen/in/en/shop/standards--reagents/186001861-rapigest-sf-1-mg--5-pk.html

  • Pएजिलेंट से पीएस साइलेंट सर्फेक्टेंट
    https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/400500.pdf

  • सिग्मा से डिटर्जेंट-मुक्त बफर
    https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/technical-documents/protocol/protein-biology/protein-lysis-and-extraction/extraction-from-tissue

• डिसल्टिंग और बफर एक्सचेंज के बाद, प्रोटीन क्वांटिफिकेशन करें। नमूने (प्रोटीन) की सांद्रता 1 मिलीग्राम/एमएल होनी चाहिए और 100 माइक्रोलीटर की आवश्यकता होती है (100 माइक्रोलीटर में 100 माइक्रोग्राम)। यदि आपके नमूने की सांद्रता 1 mg/mL से कम है, तो हमें पहले से बताएँ।

• यदि आपके पास तुलना करने के लिए नमूने हैं (सापेक्ष प्रोटीन मात्रा निर्धारण के लिए), तो सभी नमूने एक समान सांद्रता और मात्रा में होने चाहिए।

• हमारा सुझाव है कि आप प्रोटीन अलगाव प्रोटोकॉल (जिसका आप पालन करना चाहते हैं) को सुविधा कर्मचारियों के साथ साझा करें और नमूना तैयार करने से पहले उनकी स्वीकृति प्राप्त करें।

• शिपमेंट:नमूनों को सूखी बर्फ में जमी हुई स्थिति में भेजा जाना चाहिए या हाथ से बर्फ में RGCB में लाया जाना चाहिए।